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ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅱ - HILIC的分离机制
点击次数:188 发布时间:2019-04-26

HILIC分离机制

HILIC是一种复杂的分离技术,通过多种相互作用模式来实现保留。

这些相互作用的权重(中哪种是主要作用)是基于固定相、流动相和分析物的理化特性。

为了得到可靠和稳健的HILIC方法,了解潜在的不同相互作用(了解可能存在的不同相互作用)是很有帮助的。

这样可以为待进行的方法开发合理选择色谱柱和条件。(这样可以为方法开发的色谱柱和条件做出合理的选择)
HILIC中的流动相通常包含大量的乙腈(>70%)以及至少3%的水。

水性组分使得极性固定相周围存在亲水环境,并且形成吸附水层以便分析物分散(分配)。

主要的HILIC保留机制包括:
分析物分散(分配)到吸附水层,各种极性相互作用和静电(即离子交换式)相互作用(参见图3)。

如果将极性分析物通入(极性分析物进入)HILIC环境中,则可使用这些保留机制中的任意一种(则物质的保留可能是任何一种机制作用,也可能是所有机制同时作用)。

图3
潜在HILIC保留机制图示

极性分析物通常包含能够与其它极性基团相互作用的各种基团,如:固定相上的基团。极性相互作用包括氢键和偶极-偶极与其它基团的相互作用。带

电分析物也可以进行静电或离子交换式相互作用,其中分析物可以被固定相吸引或排斥。

例如,一个带负电的或酸性的分析物会被带负电的(即酸性的)固定相排斥。

但是,带正电的或碱性的分析物可被带负电的(酸性的)固定相保留,反之亦然。

 

ACE HILIC色谱柱固定相:

过去,许多HILIC固定相都采用非键合硅胶。

这些酸性相提供了必要的相(固定相必要的)极性,以在(使其能)HILIC模式中与高有机物含量洗脱剂很好地相互作用。

非键合硅胶相很有(好)用,所以仍在广泛使用。

最近,在市场上已经可以买到专门用于HILIC环境的各种键合相(固定相)。

这些新的极性键合相根据相(固定相的)特性可分为很多种,包括酸性的、碱性的、中性的和新型的化学相。

ACE HILIC组合目前包括酸性的、中性的和碱性的固定相。

这些相已被证实可相互提供不同的选择性。
这些(三款)ACE相(固定相)彼此提供了替代选择性,可参见图4.九种组分混合物中的中性和带电分析物,在相同条件下,对三种不同的ACE HILIC相(在三款不同固定相的ACE HILIC色谱柱上)显现出不同的保留和洗脱顺序。

这清楚地表明:HILIC模式下各ACE HILIC固定相之间存在选择性差异,使得这三种色谱柱成为HILIC方法开发的理想选择。

图4
ACE HILIC固定相范围内洗脱顺序的对比
色谱柱:150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相:10 mM甲酸铵,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
温度:25 °C
检测:UV, 254 nm
样品:
1) 对氨基苯甲酸
2) 4-羟基苯甲酸
3) 烟酰胺
4) 醋丁洛尔
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛尔
9) 2’-脱氧鸟苷

 

ACE HILIC-A相

ACE HILIC-A相能形成负电荷,并显示出高(强)阳离子交换能力。

带电的碱基(碱性物质)对ACE HILIC-A相进行(产生)静电吸引,而带电的酸性物质则被排斥。
ACE HILIC-A相的带电程度取决于流动相的pH值。

ACE HILIC范围的推荐pH限值为pH2.0到pH7.0。

通过增大pH值,固定相上的负电荷将变得更明显,从而保留更多的阳离子分析物。

 

ACE HILIC-N相

中性ACE HILIC-N相对阴阳离子都显示出较低的离子交换能力。

ACE HILIC-N相的保留机制包括极性相互作用、吸附和一定程度的分散(分配能力)。

 

ACE HILIC-B相

ACE HILIC-B相具有合理的阴离子交换能力,从而可保留酸性分析物,同时碱性分析物将被排斥。

与ACE HILIC-A相似,pH值可影响固定相的电荷,因此可减弱或增强该相的正特性(该相的正电荷特性)。

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