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ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅳ - HILIC仪器兼容性
点击次数:112 发布时间:2019-04-26

ACE HILIC色谱柱检测器兼容性

HILIC是一种能很好兼容众多主流检测器的技术。因此,检测的(检测器的)选择受检测器可用性、所需的检测限制和分析物的理化特性(即:具有发色团或电荷)等综合因素的影响。

 

UV-Vis检测器

UV-Vis检测器是分析试验室中最常见的检测器之一。

根据仪器的不同,一次可记录多个波长,以优化分析物覆盖范围。

有时,混合物中的分析物可通过参考紫外光谱库来快速识别。

图10中的例子示出了五种β受体阻滞剂的分离,这些阻滞剂可通过他们不同的图谱清楚识别(识别清楚)。

图10
五种β受体阻滞剂的色谱图和紫外光谱
色谱柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流动相:10 mM甲酸铵pH3.0(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
温度:25 °C
检测:UV, 214 nm
样本:
1) 普萘洛尔
2) 醋丁洛尔
3) 索他洛尔
4) 沙丁胺醇
5) 阿替洛尔

 

折射率检测器

示差折光测器(RID)测量当通过检测器时分析物峰相对参考溶剂(即流动相)的折射率。如果这二者之间存在差别,色谱图中可观察到峰。

RID对缺乏活性发色团的分析物很有用,尤其常用于糖分分析。
RID存在几个方面的劣势。这些劣势包括灵敏度受限和没有峰相关的信息(峰的身份通常需要单独的标准来验证)。

此外,RID只能用于等度条件,因为洗脱剂(洗脱剂组成变化)会改变折射率响应。

作为物理测量,折射率也很受温度的影响,也就是说,基线噪声和再现(重现)性会发生变化。

 

蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器(ELSD)通过如下方式工作:从LC上喷射输出洗脱液与惰性气体(通常为氮气),以形成液滴在加热室内去溶剂化。

去溶剂化后的分析物被分散的光源击中,然后进行检测(喷射出惰性气体来雾化从LC中输出的洗脱液,形成液滴后在加热管中蒸发,去溶剂的分析物被分散的光源击中然后进行检测)。

探测器(ELSD)需要挥发性洗脱剂,以使HILIC非常适合(HILIC方法就非常适合这款检测器)。ELSD是RID有效的替代选择,因为它非常适合非(无)发色团分析物,灵敏度更高,并且适用于梯度色谱法。

但是,ELSD不提供光谱信息,因此在没有标准的情况下,较难识别峰值(峰的识别很困难)。
对于HILIC分离(分析物),ELSD对发色团有限(有限发色团)的极性分析物更有利,例如甲基丙二酸(MMA)和琥珀酸(图11)。

MMA用作维生素B12缺乏症的生物标志,但琥珀酸与MMA等压(元素相同),因此必须彻底解决以防止假阳性结果。

采用ELSD的HILIC法,其MMA量化比紫外线检测法更好。

图11
甲基丙二酸和琥珀酸的色谱图
色谱柱:ACE 5 HILIC-B,
150 x 4.6 mm
流动相:10 mM
甲酸铵pH3.0(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
温度:25 °C
检测:ELSD
样本:
1) 琥珀酸
2) MMA

 

质谱仪

质谱仪(MS)是LC分离中信息最丰富的检测技术。

LC的洗脱剂流通常使用惰性气体(如氮气)去溶剂化(LC流出的洗脱液在加热管中被惰性气体去溶剂化),并在检测前电离。

可使用不同的质谱分析仪,如:四极质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪等。有机物含量较高的HILIC洗脱剂特别适合MS检测。

有多个电离源可用,根据具体应用进行选择。

喷雾电离质谱(ESI)很常用,但也使用电晕放电和光电离源。MS具有高度专一性,因为可利用选择性离子检测(SIM)进行跟踪(因为可以使用选择离子性监测来跟踪单个物质的荷质比(m/z),得到更好的选择性),提高灵敏度。MS还可以在不同质量范围内执行扫描,这对未知的样本(样品)很有帮助。

但是,MS扫描通常灵敏度小得多。(具有更小的灵敏度。)

MS可用于检测发色团较弱或者没有发色团的分析物。

作为一种识别工具,MS对HILIC应用也很有帮助,这种应用中分析物具有相似的紫外光谱特性,但质量不同(在HILIC应用中,当分析物具有相似的紫外光谱特性,但质量不同,MS是很有用的识别工具)。

核酸碱基和核苷就是一个很好的HILIC例子。极性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱非常相似(图12)。

 

图12
腺嘌呤、腺苷和2’-脱氧腺苷的紫外光谱对比
蓝色轨迹:腺嘌呤
红色轨迹:腺苷
绿色轨迹:2’-脱氧腺苷
色谱柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流动相:10 mM甲酸铵,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
温度:25 °C
检测:UV
进样量:2 μL

 

MS可利用这些分析物不同的质荷比进行检测和识别峰(图13)。SIM用于提高灵敏度。

 

 

图13
利用UV和MS联合检测法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷
(a)下列物质的紫外光色谱图:
1) 2’-脱氧腺苷(m/z 252.4)
2) 腺嘌呤(m/z 136.1)
3) 腺苷(m/z 268.3)
(b) 通过MS SIM确认峰
色谱柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流动相:10 mM甲酸铵,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
温度:25 °C
检测:UV,254nm和MS

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