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ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅴ - HILIC法平衡要点
点击次数:102 发布时间:2019-04-26

HILIC法平衡时间

在RPLC模式下,可再现保留所需的典型柱平衡约为10倍柱体积。

图14中可清楚反映这一点
但是,对于HILIC分离则不同。通常,HILIC色谱柱的平衡时间比RPLC色谱柱的更长。

这是该技术的一个特点,也是可再现保留所必需的。
在固定相粒子周围建立和形成稳定的水合层对可再现HILIC色谱法很重要(HILIC色谱法的重现性至关重要)。

所花费的时间也因相位(固定相)特性、洗脱剂和分析物而各有不同,因此取决于具体应用。

下面的指导原则可用作近似法(近似的参考)。

重要的是:在HILIC方法开发中,平衡将作为各项分离的一个参数进行研究(对于每一个成熟的分离方法,在HILIC方法开发时,平衡时间都将作为一个参数进行研究)。
对于全新的未使用色谱柱,建议使用60-80倍柱体积,以在最初建立HILIC所需的水层。

 

图14
RPLC和HILIC模式中达到全新未使用色谱柱所需的柱体积数的对比

一旦建立水层,可实现可再现(重现性)和一致的保留和色谱法(可实现色谱方法的重现性,一致的保留时间)。
运行完成后,应清洗色谱柱并根据第9节中相关指导说明储藏。

对于色谱柱第二次以及之后的每次运行,建议只采用20倍柱体积,以达到稳定的保留次数(时间),见图15。

 

图15
HILIC模式中第二次及随后每次分析达到平衡所需的柱体积数对比
色谱柱:ACE 5 HILIC-A,
100 x 3.0 mm
流动相:10 mM甲酸铵,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:0.43 mL/min
温度:25 °C
检测:UV, 214 nm
样本:
1) 2’-脱氧鸟苷
2) 4-羟基苯甲酸
3) 沙丁胺醇

 

梯度HILIC平衡

同时,ACE HILIC相也可以使用可再现梯度HILIC法(ACEHILIC色谱柱也可重现HILIC方法的梯度洗脱)。

经确定,两次进样之间大约需要10倍柱体积。两次进样之间的平衡时间低于新色谱柱所需的时间,因为只需要重新建立起始条件。

新色谱柱需要平衡,以在固定相颗粒上形成水合层(而新色谱柱需要长时间平衡,是因为需要在固定相颗粒上形成水合层)。

 

图16
显示了两次进样之间使用20倍柱体积平衡情况下,两次连续进样梯度HILIC分析的极佳保留再现性。

 

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