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ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅵ - HILIC应用实例
点击次数:128 发布时间:2019-04-28

ACE HILIC法开发平台和工作实例

图17显示了HILIC方法开发的流程图。
一般方法是:收集分析物相关的信息(如果已知的话),针对三个ACE HILIC相(用三款不同的ACE HILIC色谱柱在不同的pH洗脱液条件下)执行梯度或等度HILIC筛选实验(取决于样本分析物的亲水性范围),然后再优化色谱法以达到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC筛选条件。

这些设计旨在探索广泛的选择性范围,以及为达到所需分离提供一个良好的起点。

图17
ACE HILIC 方法开发流程图

表1
ACE HILIC筛选实验的条件

 

参数                            备注

色谱柱

ACE HILIC-A, ACE HILIC-B and ACE HILIC-N, 150 x 4.6 mm, 5 µm

梯度流动相

A10 mM甲酸铵(溶于MeCN/H2O中)(94:6 v/v

B10 mM甲酸铵(溶于MeCN/H2O中)(50:50 v/v)甲酸铵的pH值为:3.04.76.0.

 

 

 

梯度筛选

时间                                               %B

0

0

15

100

20

100

21

0

41

0

等度流动相

10 mM甲酸铵(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)甲酸铵的pH值为:3.04.76.0.

流速

1.5 mL/min

温度

25 °C

检测

取决于样本(视样品而定)

 

ACE HILIC色谱柱保存方法

使用之后,ACE HILIC色谱柱应使用体积比为7:3的乙腈和水进行冲洗,清除掉所有的缓冲盐。

然后,使用100%的异丙醇、以更低的流速进行冲洗,以便贮存。应往回拧紧色谱柱端盖(拧紧色谱柱端盖),并将色谱柱放回盒内。

每次分析运行之后,除非第二天要使用,否则建议采用密闭法(按长期保存的方法)清洗色谱柱,然后用异丙醇冲洗。

 

实例1 – 咖啡茵和相关化合物

方法开发中所需的咖啡和四种相关化合物(可可碱、茶碱、次黄嘌呤和黄嘌呤)这些化合物都是极性的中性物质,其中负log P值表示合理的亲水性(log P为负值明确的表明其亲水性),因此适用于HILIC(图18)。

图18
咖啡和相关物质的结构和log P数据

 

咖啡分分时时彩和相关化合物在pH为3-6的情况下不可电离,因此洗脱剂的pH几乎不会直接影响分子。

为此,选择pH 3.0和4.7。

固定相会受洗脱剂pH变化的影响,这可能是有利的一面。

固定相的电离变化将影响粒子周围的水合层,这会影响分析物分散到相中(分配在固定相上)或形成氢键的程度。

因此,在pH3.0和pH4.7的情况下对三个固定相进行筛选,结果如图19中所示。
新的ACE HILIC色谱柱使用60倍柱体积相互平衡(平衡),以在粒子周围形成水合层。表1中显示了流动相、梯度和温度。
筛选结果显示:三个固定相与两个pH值之间观察到一些选择性差异(三个固定相在两个pH值下的筛选结果可以看出彼此间具有选择性的差异)。

基于筛选数据的最有效分离是针对pH为3.0下的(pH为3.0下的)ACE HILIC-N相。

这些数据选择(选定这些条件)用于进一步优化。

 

图19
ACE HILIC色谱柱的梯度筛选


条件如表1中所述,275nm条件下的检测除外。进样25mg/mL的咖啡混合物2μL(使用pH3.0和pH4.7的甲酸铵,以0.5%w/w的比例混合相关物质和MeCN/H2O(90:10 v/v))
样本:
1) 咖啡
2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

 

较早洗脱峰的保留窗口(时间段)非常窄,这表示:等度HILIC可用于分离分析物。(等度方式的HILIC可以被用于分离这些化合物)10mM甲酸铵,pH3.0(溶于MeCN/H2O中)(94:6 v/v)被选为等度条件(图20)。

在这些条件下,峰4和5要保留得更多(好),但峰2和3仍未解析出(被分离)。
分分时时彩根据梯度运行的结果,乙腈含量更高似乎不会提高峰2和3的解析度(高的乙腈含量没有提高2与3峰的分离度),所以梯度HILIC分析得到改善(所以梯度分析是对混合物分离有更合适的,温度将被研究),从而开发出最终方法,如图21所示。

 

图20
ACE HILIC-N相中咖啡分分时时彩和相关化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡和相关化合物的等度分析
色谱柱:ACE 5 HILIC-N,
150 x 4.6 mm
流动相:10 mM甲酸铵,pH3.0(溶于MeCN/H2O中)(94:6 v/v)
流速:1.5 mL/min
温度:25 °C
检测:UV, 275 nm
进样:2 μL
样本:
1) 咖啡
2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤

 

温度的降低会提高茶碱与可可碱之间的解析度(分离度),因此,最终方法(图21)被认为适合其用途。

 

图21
最终开发方法:

色谱柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流动相:A = 10mM甲酸铵(pH3.0)溶于MeCN/H2O中(96:4 v/v)中 B = 10mM甲酸铵(pH3.0)溶于MeCN/H2O(1:1 v/v)中
梯度:0-100%B在15分钟内,100%B持续5分钟,下一次进样维持在起始条件20分钟
流速:1.5 mL/min
温度:15 °C
检测:275 nm
进样:2 μL

 

实例2 – 肌酸和肌酐

肌酸(图22)是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在为体内细胞提供能量方面起着重要作用(在体内主要用于为细胞供能),并形成(生成)副产品肌酐。测定血液中的肌酐,确定肾功能是否正常,其中肌酐水平的增加表示肾可能不会完全过滤废物。(升高表明肾的过滤废物的功能有所降低)

图22
结构和log P肌酸和肌酐数据

图23
使用pH为3.0、4.7和6.0的甲酸铵对ACE HILIC范围的等度筛选对比
样本:
1) 肌酐
2) 肌酸

在三种pH值条件下,利用等度条件对三个HILIC固定相的两种分析物进行筛选。

结果表明:肌酐在三个ACE HILIC相中被适当地保留,但由于过度保留的原因,肌酸在合理的时间内没有洗脱。

根据图17中的流程图,过度保留窗口表示梯度(宽时间段表明梯度方法)可能更适宜。

 

图24
ACE HILIC-A相下的最终方法

ACE HILIC-A在pH3。0下选择,进行梯度分析。

标准梯度在10分钟内析出两种目标分析物,并且解析度很高(分离度很高)(数据未显示)。因此,这使得梯度时间进一步减少(这种情况下可以使梯度运行时间进一步减少),从而缩短了整体运行时间。

最终方法如图24中所示。

色谱柱:150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相:
A:2 mM甲酸铵(pH3.0)溶于MeCN/H2O(90:10 v/v)中
B: 2 mM甲酸铵(pH3.0)溶于MeCN/H2O(50:50 v/v)中
梯度:5-55%B,在10分钟内
流速:1.5 mL/min
检测:230 nm
进样:5 μL
样本:
1) 肌酐
2) 肌酸

 

结论

HILIC是一种用于多用途的极性分析物色谱分析法(对于极性化合物来说是一种通用的色谱分析模式)。

这种方法比较复杂,但如果遵循简单规则,则可实现可再现的HILIC方法(HILIC方法是可以重现性的)。

三个ACE HILIC相(固定相)设计用于HILIC方法开发期间研究选择性,并尽可能快地提供实现所需分离的选项。

ACE HILIC方法验证协议(规程)已成功用于开发一系列的HILIC方法,应为HILIC方法开发活动提供一种结构化的方法。

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