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蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南七
点击次数:80 发布时间:2019-06-20

蛋白质氧化 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南


在氧化环境条件下,尽管蛋白质的几个氨基酸都可能受影响,但最有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸;甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亚砜(图34)。
对甲硫氨酸残基的氧化取决于其在蛋白质中的位置。埋藏在蛋白质内部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且与溶剂接触的甲硫氨酸侧链最有可能被氧化。
氧化条件包括热、过渡金属的存在以及溶液中氧气的存在。
同脱酰胺作用一样,甲硫氨酸的氧化可能导致生物活性的丧失或减弱,或者,在一些情况下对生物活性无影响。
这取决于甲硫氨酸在蛋白质中的位置。但另一方面,甲硫氨酸亚砜的存在说明蛋白质经受过氧化条件,因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白质经受过胁迫条件。

34. 在氧化环境条件下,甲硫氨酸被氧化为甲硫氨酸亚砜。

 

35. 天然蛋白水解产生的重组人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色谱法分离。

 

 

条件

色谱柱:C4 宽孔柱, 4.6 x 250 毫米

流动相:37~47% 乙腈-0.1% TFA体系,30分钟梯度洗脱。

样品:被过氧化氢部分氧化的重组人凝血因子 VIIa。

 

通常会监测蛋白质治疗药物的氧化反应,因为它既可能影响生物活性,也可作为一种指示。
甲硫氨酸的氧化反应会导致蛋白质疏水性下降,因此在反相HPLC中,氧化蛋白会先于天然蛋白洗脱出来,如图35所示。
重组人凝血因子VIIa(rCF VIIa)被过氧化氢部分氧化后利用反相HPLC对溶液进行分析。
氧化蛋白(两个甲硫氨酸残基被氧化)先洗脱出来。
只有一个甲硫氨酸被氧化的两种蛋白随后洗脱出来,最后是天然蛋白。四种蛋白具有良好的分辨率。
尤其是只有一个甲硫氨酸被氧化的两种蛋白间分辨率很高。这几种蛋白均有一个氧化甲硫氨酸,仅区别于被氧化甲硫氨酸的不同。

通常利用肽图监测甲硫氨酸的氧化。
如图36所示,含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰时间早很多。
T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脱出来;T11 metox先于天然 T11洗脱出来,使得鉴别和监测更容易。

 

图36. 部分氧化的人生长激素的肽图。

 

条件

色谱柱:C18宽孔柱,4.6 x 250 mm

流动相:0~40% 乙腈—0.1% TFA体系,梯度洗脱,120分钟。

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